os Reagentes e os anticorpos

de cultura de Células

A próstata humana linhas de células de câncer PC3, DU145, Cv, LNCaP, e 22Rv1 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) e mantidos em RPMI 1640 (Invitrogen, Waltham, MA) com 5 a 10% inactivadas pelo calor de soro bovino fetal (FBS), 100 unidades/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina em 5% de CO2 da atmosfera a 37 °C. Após o consentimento informado, o câncer de próstata tecidos foram obtidos a partir de pacientes que foram submetidos paliativos ressecção transuretral da próstata para aliviar a obstrução da saída da bexiga e posteriormente foram diagnosticadas com câncer de próstata no Centro Médico de Asan. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão Institucional do Asan Medical Center. Os espécimes tumorais foram picados com tesoura e digeridos por incubação em RPMI contendo 1 mg / mL de colagenase tipo I (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) por 1 h a 37 °C. As células foram lavadas com meio contendo 10% de FBS para inativar a colagenase e depois com PBS para remover FBS. Em seguida, as células foram chapeadas e mantidas em meio de crescimento de células epiteliais da próstata humana (Lonza, Portsmouth, NH) em uma atmosfera de CO2 a 5% a 37 °C. para garantir autenticação e consistência ao longo do estudo, apenas células de baixa passagem (< passagem 8-15) foram usadas nos experimentos. O teste de Mycoplasma foi realizado usando um kit de teste de e-mycoplasma baseado em PCR (Intron Biotechnology, Seongnam, Coréia) para todas as células.

ensaio de viabilidade celular a viabilidade celular foi medida usando o ensaio de viabilidade celular CellTiter Glo® (Promega, Madison, WI). Resumidamente, 3 × 103 células foram semeadas por poço em placas de 96 poços e incubadas durante a noite. Após a exposição ao CWP232291, as células foram incubadas com 20 µL de reagente CellTiter Glo por 10 min, após o que a intensidade de luminescência foi medida em um luminômetro MICROLUMATPLUS LB (por exemplo,&G Berthold, Bad Wildbad, Alemanha). Todas as placas tinham poços em branco contendo meio livre de células para medir a luminescência de fundo. Os dados representam a porcentagem de células controle não tratadas expressa como a média ± DP de pelo menos três repetições. Os resultados foram analisados utilizando o software GraphPad Prism ® versão 6. As concentrações da droga que reduziram a resposta a 50% do controle (IC50) foram determinadas para cada linha celular. ensaio de Citotoxicidade da lactato desidrogenase o ensaio de citotoxicidade celular foi realizado usando o Kit De Detecção de Citotoxicidade (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 3 × 103 células foram semeadas por poço em placas de 96 poços e incubadas durante a noite. Após a exposição ao CWP232291, 50 µL de meio amostral (dos tratamentos dependentes de controle e concentração) foram transferidos para uma placa de 96 poços em poços triplicados. A mistura de reação (50 µL) foi então adicionada a cada amostra e incubada por 30 min no escuro à temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de 50 µL de solução de parada e mistura por batida suave. A absorvância foi medida em 492 nm e 680 nm. O valor de absorbância de 680N m (fundo) foi subtraído dos valores de absorbância de 492 nm antes do cálculo da % citotoxicidade. A atividade máxima da lactato desidrogenase (LDH) foi determinada após o tratamento da célula com tampão de lise, conforme descrito no protocolo do fabricante. A citotoxicidade (%) foi calculada usando a seguinte fórmula:

citotoxicidade (%) = (atividade LDH tratada com CWP-baixa atividade LDH) / (atividade LDH alta-baixa atividade LDH) X 100.

Análise de Western blot lisados de células inteiras foram preparados em tampão de lise contendo coquetel de inibidor de protease (Sigma Aldrich). Os lisados celulares foram microcentrifugados a 13.000×g por 10 min, e os sobrenadantes foram armazenados a − 80 °C. A concentração de proteína foi medida usando o ensaio de proteína Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). As proteínas foram separadas por eletroforese e transferidas para a membrana PVDF. Após o bloqueio com 5% de albumina sérica bovina (BSA) por 1 h à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas com anticorpo primário, depois com anticorpo secundário conjugado com peroxidase. As bandas proteicas foram detectadas usando o sistema de detecção de quimioluminescência (Millipore Corp., Billerica, MA). extração de RNA e análise quantitativa de RT-PCR o RNA Total foi extraído de linhas celulares não tratadas ou tratadas com Cwp232291 usando Trizol® (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA tratado com DNase foi reversamente transcrito usando um kit de síntese de cDNA (Toyobo, Osaka, Japão). A PCR quantitativa foi realizada pelo método SYBR (Toyobo). As condições de ciclagem térmica por PCR foram as seguintes: 95 °C por 20 s, seguido por 40 ciclos de 95 °C por 3 s e 60 °C por 30 s. O estágio da curva de fusão prosseguiu a 95 °C por 15 s, derretendo de 60 °C por 1 min a 95 °C por 15 s com uma taxa de rampa de 1% e 60 °C por 15 s. A análise da curva de fusão foi realizada para garantir a especificidade dos produtos PCR. O GAPDH foi selecionado para referência interna e controle de carregamento. Os seguintes primers foram utilizados: PIQUE para a frente, 5′-AGAACCAGGAAACGGAAACAGA-3′, inversa, 5′-TCTCCTTCATGCGCTGCTTT-3′; AR para a frente, 5′-CAGTGGATGGGCTGAAAAAT-3′, reverse 5′- AAGCGTCTTGAGCAGGATGT-3′; PSA para a frente, 5′-CATCAGGAACAAAAGCGTGA-3′, inversa, 5′-ATATCGTAGAGCGGGTGTGG-3′; UBE2C forward, 5′-AGTGGCTACCCTTACAATGCG-3′, reverse, 5′-TTACCCTGGGTGTCCACGTT-3′; UGT2B17 forward, 5′- ACCAGCCAAACCCTTGCCTAAG-3′, reverse, 5′-GGCTGATGCAATCATGTTGGCAC-3′; TMPSS2 forward, 5′-CAGGAGTGTACGGGAATGTGATGGT-3′, reverse, 5′-GATTAGCCGTCTGCCCTCATTTGT-3′; c-myc forward, 5′- GCTGCTTAGACGCTGGATTT-3′, reverse, 5′- GGCATTCGACTCATCTCAGC-3′; cyclin D1 forward, 5′- ATGTTCGTGGCCTCTAAGATGA-3′, reverse, 5′- CCAGTGGTTACCAGCAGCTC-3′; MMP-7 forward, 5′- TGAGCTACAGTGGGAACAGG-3′, reverse, 5′- ACCACCCCAAAGAAAATTCC-3′; Annexin-2 forward, 5′-ACGCTGGAGTGAAGAGGAAA-3′, reverse, 5′- AAGGCACTGAGACTCCCTCA-3′; Axin-2 forward, 5′- AGTGTGAGGTCCACGGAAAC-3′, reverse, 5′- TGGCTGGTGCAAAGACATAG-3′; and GAPDH forward, 5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′, reverse, 5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′.

Immunofluorescence staining and confocal microscopy

Cells were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 20 min and permeabilized with 0.1% Triton X-100 in PBS for 30 min. Os locais de ligação não específicos foram bloqueados com 5% de BSA em PBS por 1 h, depois as células foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpo primário contra AR seguido por anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente (sondas moleculares, Eugene ou). As amostras foram montadas em meio Vectashield contendo 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (Dapi) (laboratórios vetoriais, Burlingame, CA). As imagens confocais foram obtidas por meio de um sistema confocal de microscopia a laser (Leica Geosystems, Heerbrugg, Suíça). transient transfection and dual luciferase reporter assay o TCF / LEF reporter construct é uma mistura de um construto luciferase indutível β-catenina responsivo e um elemento Renilla expresso constitutivamente. A construção da luciferase responsiva à β-catenina codifica o gene repórter da luciferase do vaga-lume sob o controle de um promotor mínimo (m) CMV e repetições em tandem do elemento de resposta transcricional TCF/LEF. Para transfeccao, as células foram semeadas em 3 × 105 células/poço (PC3, DU145) e 6 × 105 células/poço (LNCaP, 22Rv1) em 6 placas de poços. Após 18-24 h, as células foram transfectadas com 1 µg de TCF / LEF reporter construct (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) Usando 2 µL de Lipofectamina 2000™ (Invitrogen) em 50 µL de meio de soro reduzido OptiMEM®, alcançando uma proporção de DNA/Lipofectamina 2000™ de 1:2. Após a transfecção, as células foram tratadas com ou sem 100 ng / mL WNT3A (sistemas R&D) e CWP232291 por 24 h; as células controle não foram tratadas. Os ensaios de Luciferase foram realizados usando o sistema de ensaio de dupla Glo luciferase (Promega). Cada ensaio foi realizado em triplicados, e a atividade repórter foi expressa como média ± DP.

Apoptose ensaio (annexin V coloração)

as Células foram semeadas em 6 placas de poços em RPMI 1640 meio contendo 10% de FBS por 18-24 h. As células foram, então, expostas ao CWP232291 por 72 h, após o que a apoptose e a necrose foram avaliados por citometria de fluxo, usando o annexin V-FITC apoptose de detecção do ensaio (BD Biosciences, Bedford, MA), em conformidade com as instruções do fabricante. Neste ensaio, as células positivas para a anexina V (quadrante inferior direito) e as positivas para a anexina V e o iodeto de propídio (PI) (quadrante superior direito) representam as populações apoptóticas precoce e tardia, respectivamente, enquanto as células positivas apenas para PI (quadrante superior esquerdo) representam a população necrótica. A análise da população celular de apoptose foi realizada utilizando o software CellQuestPro (BD Biosciences). modelos de xenoenxerto tumoral os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) do Asan Medical Center (2015-14-182). Células 22RV1 (5 × 106) foram injetadas subcutaneamente nos flancos dorsais direitos de camundongos nus BALB/c machos de 6 semanas de idade (OrientBio, Seul, Coréia). Quando os tumores atingiram um volume médio de 70-100 mm3, os camundongos foram divididos aleatoriamente em grupos de controle e tratamento. Os camundongos foram tratados com CWP232291 em 3% de dimetilsulfóxido em solução salina tamponada com fosfato, e os grupos controle receberam um volume igual do diluente correspondente isoladamente. Camundongos Portadores de 22rv1 receberam cwp232291 intravenoso (veia da cauda) (50 ou 100 mg/kg/dia) ou veículo sozinho uma vez por semana durante 4 semanas (n = 6 por grupo). O volume tumoral foi medido três vezes por semana e calculado usando a seguinte fórmula: 0,52 × comprimento × (largura) 2 (Comprimento: diâmetro mais longo através do tumor; largura: diâmetro perpendicular correspondente). O perfil concentração-tempo do metabólito ativo (CWP232204) após uma única injeção intravenosa de CWP232291 em camundongos nus é mostrado no arquivo adicional 1: Figura S1, e as variáveis farmacocinéticas CWP232291 são mostradas no arquivo adicional 1: Tabela S1. análise estatística os dados foram obtidos de pelo menos três experimentos independentes e apresentados como médias ± DP. A avaliação estatística dos resultados foi realizada por ANOVA unidirecional e bidirecional com teste de comparações múltiplas de Dunnett. Os valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Prism 6 (Software GraphPad) foi utilizado para calcular e analisar as diferenças estatísticas entre os grupos experimentais.

CWP232291 induz apoptose em células de câncer de próstata primeiro, investigamos se CWP232291 induz apoptose em células de câncer de próstata. Selecionamos quatro células de câncer de próstata: PC3 e DU145 (AR-negativo e andrógeno-independente), LNCaP (AR-expressar-se e andrógeno-dependente), e 22Rv1 (AR-expressar-se e andrógeno-independente). A análise de citometria de fluxo de células cancerígenas da próstata duplamente marcada com a anexina V e PI mostrou que a apoptose induzida por CWP232291 (Fig. 1a). Além disso, a exposição de células de 72 h para uma concentração de CWP232291 equivalente ao IC50 (PC3, 200 nM; DU145, a 400 nM; LNCaP, 60 nM; 22Rv1, 70 nM) aumentou significativamente a apoptose em comparação com o controle no PC3, DU145, LNCaP, e 22Rv1 células. Ao mesmo tempo, a caspase-3 clivada e a PARP clivada foram significativamente aumentadas em CWP232291 em comparação com o controle (Fig. 1b). os níveis de mRNA de Axina-2, um regulador negativo da sinalização canônica WNT, foram aumentados em células de câncer de próstata após o tratamento com doses IC50 de CWP232291 (Fig. 1c). Inibição da atividade da caspase com Zvad-FMK, um inibidor de pan-caspase permeável a células, AB-rogou apoptose induzida por CWP232291, demonstrando que CWP232291 mata células através da via da caspase (Fig. 1d).

Fig. 1

CWP232291 induz apoptose e parada do ciclo celular em células de câncer de próstata. as células foram expostas a CWP232291 por 72 h no IC50. As células coradas com anexina V / PI foram avaliadas por citometria de fluxo. A presença de células positivas para anexina V e Pi-negativas mostrou morte celular apoptótica, e a presença de células positivas para anexina V e Pi-positivas mostrou apoptose tardia e morte celular necrótica. as células b foram expostas ao CWP232291 por 72 h no IC50. Alterações na caspase, PARP-1 e proteínas indicadas foram analisadas por Western blotting. as células C foram expostas a doses de IC50 de CWP232291 por 24 h (PC3, 200 nM; DU145, 400 nM; LNCaP, 60 nM; 22RV1, 70 nM). Os níveis relativos de mRNA de Axina – 2 foram quantificados por PCR em tempo real em células de câncer de próstata (médias ± DP, n = 3, *P < 0,05 em comparação com o controle não tratado). as células d foram expostas a CWP232291 por 96 h no IC50 (PC3, 200 nM; DU145, 400 nM; LNCaP, 60 nM; 22RV1, 70 nM) na presença ou ausência de 10 µmol/L Z-VAD-FMK. A viabilidade celular foi expressa como a média ± DP de três experimentos independentes. * P < 0.05 por ANOVA one-way

CWP232291 induz retículo endoplasmático estresse e desdobrado proteína de resposta

em seguida, investigamos se CWP232291 induz retículo endoplasmático (ER) stress e desdobrado proteína de resposta (UPR). O estresse do ER desencadeia o UPR, que é mediado por três sensores: proteína quinase RNA-como ER quinase (PERK), enzima 1 que requer inositol (IRE1) e fator de transcrição de ativação 6 (ATF6) . A ativação do PERK atenua a iniciação da tradução global via fosforilação do fator de iniciação da tradução eucariótica 2α (eIF2a), resultando em aumento da expressão do CHOP proapoptótico . As células foram expostas ao CWP232291 por 24 h no IC50 (PC3, 200 nM; DU145, 400 nM; LNCaP, 60 nM; 22RV1, 70 nM), após o que os marcadores relacionados ao estresse do ER foram avaliados por Western blotting e PCR em tempo real (Fig. 2). Um aumento dependente da concentração na fosforilação da proteína eIF2a, proteína IRE1 e proteína CHOP e mRNA foi observado, sugerindo que CWP232291 induz estresse ER. Tomados em conjunto, esses dados indicam que CWP232291 induz estresse ER, resultando em Ativação PERK, regulação positiva de CHOP e apoptose dependente de caspase-3.

Fig. 2

CWP232291 induz o estresse do retículo endoplasmático e a resposta proteica desdobrada em células cancerígenas da próstata. as células foram expostas a CWP232291 por 24 h. A análise de Western blot foi realizada usando anticorpos IRE1A, phospho-eIF2a, eIF2a e CHOP. Actin foi usado como um controle de carregamento. as células b foram expostas a CWP232291 por 24 h no IC50 (PC3, 200 nM; DU145, 400 nanômetro; LNCaP, 60 nanômetro; 22rv1, 70 nanômetro). Os níveis relativos de mRNA CHOP foram quantificados por PCR em tempo real em células de câncer de próstata (médias ± DP, n = 3, *P < 0,05 em comparação com o controle não tratado). as células C foram expostas a CWP232291 por 24 h no IC50 (PC3, 200 nM; DU145, 400 nM; LNCaP, 60 nM; 22RV1, 70 nM). Clivada ATF6 proteína foi analisada por western blotting

CWP232291 inibe a expressão de β-catenin em células cancerosas da próstata

A segmentação de WNT/β-catenin de sinalização por CWP232291 foi investigado. Na Via canônica WNT, os membros da família LEF / TCF são os principais mediadores da transcrição dependente de β-catenina . PC3, DU145, LNCaP, e 22Rv1 células foram transfected com uma ABL/TCF repórter luciferase construir e expostos a CWP232291 (PC3, 200 nM; DU145, a 400 nM; LNCaP, 60 nM; 22Rv1, 70 nM) na presença ou ausência de WNT3a (100 ng/mL) (Fig. 3a). Cwp232291 diminuiu significativamente a atividade da luciferase em comparação com o controle, demonstrando inibição Da β-catenina e da sobrevivência do gene alvo Wnt. De fato, Western blotting revelou que CWP232291 suprimiu marcadamente a expressão Da β-catenina e da survivina nas células do câncer de próstata de maneira dependente da concentração (Fig. 3b). Além disso, por microscopia de fluorescência, foi observada uma diminuição na quantidade de coloração Com β-catenina no núcleo das células cancerígenas da próstata expostas ao CWP232291 em comparação com o controle. Na ausência de CWP232291, a coloração Com β-catenina foi difusa e distribuída por todo o citoplasma. O tratamento de células de câncer de próstata com WNT3a aumentou a localização nuclear e a expressão de β-catenina (arquivo adicional 1: Figura S2). a coloração Com β-catenina foi menor no núcleo das células cancerígenas da próstata tratadas com CWP232291 do que no controle não tratado (Fig. 3c). Em seguida, investigamos se o tratamento com cwp232291 reduz a expressão gênica alvo da Wnt/β-catenina. os níveis de mRNA do c-myc, cyclin D1, MMP-7 e annexin-2 foram menores no LNCaP e 22Rv1 células após o tratamento com IC50 doses de CWP232291 por 24 h (LNCaP, 60 nM; 22Rv1, 70 nM) do que no controle não tratado (Fig. 3d).

Fig. 3

CWP232291 inibe a expressão de β-catenina e survivin em células de câncer de próstata. um ensaio repórter para sinalização de Wnt/β-catenina após tratamento com (+) ou sem (−) WNT3a (100 ng / mL) e CWP232291 (PC3, 200 nM; DU145, 400 nM; LNCaP, 60 nM; 22RV1, 70 nM) em culturas celulares. Os resultados são expressos como médias ± DP de três experimentos independentes. *P < 0,05 por ANOVA unidirecional. as células B foram expostas a Cwp232291 por 24 h. os lisados foram analisados por Western blotting com anticorpos β-catenina, survivin e bcl-2. Actin foi usado como um controle de carregamento. Barra de escala, 100 µm. as células C foram expostas a CWP232291 por 24 h E depois coradas com DAPI (azul) Ou β-catenina (verde). As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência (Olympus). as células d LNCaP e (e) 22rv1 foram tratadas com ou sem doses de IC50 de CWP232291 por 24 h (LNCaP, 60 nM; 22rv1, 70 nM). Em relação os níveis de mRNA do c-myc, cyclinD1, MMP-7 e annexin-2 foram quantificados por real-time PCR em células cancerosas da próstata

CWP232291 downregulates AR e de suas variantes de splicing

uma vez que β-catenin interage com o AR, é concebível que CWP232291 também pode afetar o AR de atividade. As linhagens celulares de câncer de próstata foram classificadas de acordo com o estado de RA: PC3 e DU145 (ar-negativo), LNCaP (wild-type AR), 22RV1 (ar splice variant), VCaP (AR overexpression). Para investigar os efeitos da CWP232291 na RA, a viabilidade celular foi avaliada em células de câncer de próstata ar-expressing (LNCaP, 22RV1 e VCaP) e ar-negativo (PC3 e DU145) (Fig. 4a). Depois que as células cancerígenas da próstata foram expostas a 0-10 µM CWP232291 por 72 h, a viabilidade celular foi medida. Cwp232291 reduziu a proliferação de todas as células cancerígenas da próstata. Os valores de IC50 foram menores nas células que expressam AR do que nas células ar-negativas (Fig. 4b; IC50 de 0.097 µM no LNCaP, 0.060 µM em 22Rv1, 0.070 µM em Cv vs. 0.188 µM no PC3 e 0.418 µM em DU145 células). O ensaio citotóxico de LDH foi realizado para investigar se CWP232291 tem efeitos citotóxicos em células de câncer de próstata (arquivo adicional 1: Figura S3). LDH liberado, um indicador de citotoxicidade, aumentou em concentrações de CWP232291 superiores a 0,01 µM. Western blotting mostrou que cwp232291 diminuiu a expressão de AR e suas variantes de emenda nas células LNCaP e 22rv1 (Fig. 4c). Da mesma forma, a coloração por imunofluorescência e a microscopia confocal revelaram que o CWP232291 diminuiu acentuadamente a expressão de AR nas células LNCaP e 22rv1 (Fig. 4) d.

Fig. 4

CWP232291 downregulates o receptor de andrógeno e suas variantes de splicing. um estado de AR em linhas de células de câncer de próstata. A análise de Western blot foi realizada usando anticorpos AR, AR-Vs E AR-V7. GAPDH foi usado como um controle de carregamento. as células B foram expostas a 0-10 µM CWP232291 por 72 H. A viabilidade celular foi determinada usando CellTiter Glo® (médias ± SD, n = 3). as células C LNCaP e 22rv1 foram expostas ao CWP232291 por 72 h no IC50. Western blotting foi realizado usando anticorpos AR. Actin foi usado como um controle de carregamento. as células D LNCaP e 22rv1 foram expostas ao CWP232291 por 24 h no IC50 e depois coradas com AR (vermelho) e DAPI (azul). As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência. Barra de escala, 100 µm. as células e LNCaP E (F) 22rv1 foram privadas de andrógenos por 48 h E depois tratadas com veículo ou 1 nm DHT com ou sem IC50 doses de CWP (LNCaP 100 nM; 22rv1 60 nM) por 24 h. Os níveis relativos de mRNA de AR, PSA, UBE2C e TMPRSS2 foram quantificados por PCR em tempo real em células de câncer de próstata

a regulação transcricional da AR Por β-catenina através de locais de ligação TCF / LEF no promotor de AR foi bem documentada . Para investigar se CWP232291 diretamente metas AR de transcrição, AR e seus genes-alvo os níveis de mRNA foram analisados no LNCaP e 22Rv1 células, que foram andrógeno-privada, por 48 h e, em seguida, tratados com veículo ou 1 nM DHT com ou sem IC50 doses de CWP (LNCaP 100 nM; 22Rv1 60 nM) por 24 h. Como mostrado na Fig. O tratamento 4e, CWP232291 diminuiu os níveis de mRNA AR, PSA, UBE2C e TMPRSS2, sugerindo que o CWP232291 pode direcionar diretamente a transcrição de AR. Além disso, avaliamos a atividade de elementos de resposta a andrógenos usando um ensaio de repórter. Cwp232291 suprimiu significativamente a atividade da luciferase do elemento da andrógeno-resposta em pilhas de cancro da próstata tratadas com DHT (arquivo adicional 1: Figura S4). Realizamos o ensaio de imunoprecipitação da cromatina para confirmar a regulação transcricional da AR pela β-catenina. Os resultados revelaram que cwp232291 inibe a ocupação β-catenina do local de ligação ao TCF dentro do promotor AR (arquivo adicional 1: Figura S5). cwp232291 bloqueia o crescimento de células de câncer de próstata independentes de andrógenos e células primárias derivadas de pacientes com PCR o efeito do CWP232291 foi comparado com o do padrão de atendimento e testado no contexto de resistência à castração. As células 22rv1 e VCaP, que são AR-positivas e independentes de andrógenos, foram expostas ao cwp232291 ou docetaxel. CWP232291 inibiu o crescimento de células 22rv1 e VCaP de maneira semelhante ao docetaxel (Fig. 5a). Quando testado em células de câncer de próstata resistentes ao docetaxel, CWP232291 mostrou inibição de crescimento semelhante em células du145 resistentes ao docetaxel como em células du145 parentais (Fig. 5b). Em seguida, o CWP232291 foi testado em células primárias de câncer de próstata derivadas de quatro pacientes com PCR (0-10 µM, 72 h) (Fig. 5c). Três pacientes (P1, P2 e P3) progrediram após a quimioterapia com docetaxel, e um paciente (P4) progrediu após a falha da enzalutamida. Como mostrado na Fig. 5C, CWP232291 mostrou atividade antitumoral contra todas as células cancerosas primárias da próstata. Curiosamente, o CWP232291 suprimiu o crescimento de células primárias de câncer de próstata de um paciente (P4) que progrediu após a enzalutamida, enquanto o docetaxel não foi eficaz nessas células.

Fig. 5

cwp232291 bloqueia o crescimento de células cancerígenas da próstata e células primárias derivadas de pacientes com câncer de próstata resistente à castração. as células 22rv1 e VCaP foram expostas a CWP232291 (0-10 µM) e docetaxel (0-10 µM) por 72 h. A viabilidade celular foi determinada usando CellTiter Glo® (médias ± DP, n = 3). B as células du145 resistentes ao Docetaxel e du145 parentais foram expostas a CWP232291 (0-10 µM) e docetaxel (0-10 µM) por 72 H. A viabilidade celular foi determinada usando CellTiter Glo® (médias ± SD, n = 3). C células primárias de câncer de próstata derivadas de pacientes com câncer de próstata resistente à castração foram expostas a CWP232291 (0-10 µM) por 72 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando CellTiter Glo® (média ± DP, n = 3)

CWP232291 inibe o crescimento do câncer de próstata xenoenxertos in vivo

O in vivo da atividade antitumoral de CWP232291 foi investigado no 22Rv1 xenograft modelo de mouse (Fig. 6a-e). Camundongos Portadores de tumores 22rv1 foram tratados com CWP232291 (27 dias, 50 mg/kg/dia ou 100 mg/kg/dia). Cwp232291 inibiu o crescimento do tumor em comparação com o veículo (Fig. 6a). A inibição do crescimento tumoral atingiu 52,0% (50 mg / kg / dia) e 73.7% (100 mg/kg/dia) após 27 dias de tratamento com CWP232291, enquanto o peso corporal não mudou significativamente (Fig. 6b). Cwp232291 reduziu significativamente o peso do tumor (50 mg/kg/dia: 245 mg; 100 mg/kg/dia: 160 mg; controle: 592 mg) após 27 dias em comparação com o veículo (Fig. 6c). Western blotting mostrou que CWP232291 diminuiu a expressão de β-catenina e aumentou a da caspase-3 clivada em comparação com o controle, indicando potentes efeitos inibidores do crescimento e proapoptóticos in vivo de maneira dependente do tempo e da dose (Fig. 6e).

Fig. 6

CWP232291 inibe o crescimento de xenoenxertos de câncer de próstata. camundongos Portadores de tumores 22rv1 foram tratados com CWP232291 (28 dias, 50 mg/kg/dia ou 100 mg/kg/dia). Alterações no volume tumoral dos camundongos xenografados 22rv1 são mostradas. Os resultados são expressos como as médias ± DP de seis camundongos. B o peso corporal dos ratos xenografados 22rv1 é mostrado. Os resultados são expressos como médias ± DP. c o peso do Tumor dos camundongos xenografados 22rv1 é mostrado. Os resultados são expressos como meios ± SEM. *P < 0,05 por ANOVA unidirecional. d tumores representativos dos camundongos xenografados 22rv1. e análise Western blot de β-catenina, caspase-3 clivada e GAPDH em 22rv1 em dois pares de tumores xenografados. Um western blot foi selecionado aleatoriamente do grupo controle e um do grupo de tratamento. Os borrões ocidentais foram realizados em triplicados e repetidos independentemente três vezes